Laporan Praktikum Pembuatan Pupuk Bakteri Penambat N2 (Rhizobium)

I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

    Permasalahan yang dihadapi saat ini adalah penggunaan pupuk anorganik yang terus-menerus meningkat dan semakin sedikitnya pertanian organik. Pupuk anorganik memiliki kelebihan dan kekurangan dalam mengatasi permasalahan baik tanah maupun tanaman. Sama halnya dengan pupuk organik yang juga memiliki kelebihan dan kekurangan.

    Pupuk Makro Anorganik yaitu pupuk alternatif yang merupakan sumber hara N, P, K dengan kandungan N, P2O5 dan K2O masing-masing minimal 10%. Contohnya: pupuk Urea mengandung 46% unsur N, SP-36 mengandung 36% unsur P2O5 dan KCL mengandung 50% unsur K2O. Pupuk organik yaitu pupuk yang berasal dari sisa tanaman, hewan atau manusia seperti pupuk kandang, pupuk hijau dan kompos berbentuk cair maaupun padataan yang antara lain dapat memperbaiki sifat fisik dan struktur tanah, dapat meningkatkan daya menahan air, kimia tanah, biologi tanah dengan kriteria sebagai berikut yaitu pupuk padatan mengandung bahan organik minimal 25%, sedangkan pupuk cair mengandung senyawa organik minimal 10%. Pupuk padat mempunyai rasio C:N maksimal 15.

     Pupuk anorganik (Urea, SP36, dll) kandungan haranya bersifat cepat tersedia (fast release), artinya pupuk tersebut cepat melepaskan kandungan unsur haranya, sehingga dalam beberapa jam saja, kandungan haranya dapat diserap tanaman. Sedangkan pupuk organik lebih lambat (slow release) melepaskan kandungan haranya, pupuk organik membutuhkan waktu berhari-hari. Kandungan hara pupuk anorganik lebih besar dibandingkan pupuk anorganik, sehingga penggunaan pupuk organik hanya ditujukan sebagai pupuk pelengkap saja. Karena, dalam pemanfaatannya pupuk organik akan dibutuhkan jumlah yang sangat besar untuk menggantikan pupuk anorganik. 

1.2.Tujuan

Membuat inokulum bakteri penambat nitrogen (BPN) untuk pupuk hayati dengan melalui tahap-tahap isolasi BPN, perbanyakan biakan BPN, pembuatan inokulum, dan pengujian inokulan BPN.

II. METODELOGI PRAKTIKUM

2.1. Tempat dan Waktu

Praktikum Teknologi Pupuk Hayati Acara I Pembuatan Pupuk Bakteri Penambat N2 (Rhizobium) dilaksanakan pada hari Senin, 15 April 2019 - 29 April 2019 di Laboratorium Biologi dan Bioteknologi Tanah Fakultas Pertanian UNS.

2.2.Alat dan Bahan

2.2.1. Alat

1. Shaker/mesin penggojog
2. Petridish steril
3. Erlenmeyer 100 ml dan 250 atau 500 ml 
4. Skalpel dan spatel
5. Pisau 
6. Sealer kantong plastik
7. Tabung reaksi
8. mikro pipet 1 ml
9. Drigalsky
10. Autoklaf
11. Jarum Ose
12. Bunsen
13. Baki/nampan plastik
14. Kantong plastik kemasan 50 gr atau 100 gr

2.2.2.Bahan

1. Akar tanaman pinus
2. Batang gelas, pinset, scalpel dan lampu spiritus/bunsen
3. Medium Yeast Extract Manitol Agar yang mengandung Congo Red (CRYMA) 
4. Air steril, alcohol 95% dan sublimate 0,1%
5. Medium YMA yang mengandung BTB (Bromothymol Blue), BTBYMA
6. Pembawa (carrier) yang mengandung gambut, lempung, gambut + lempung, dan dedak
7. Air steril

2.3. Langkah Kerja

2.3.1. Isolasi Bakteri Rhizobium dari Akar Pinus dan Membuat Biakan Murni 

1. Mencuci bintil akar hingga bersih, selanjutnya dimasukkan dalam alkohol 95%. 
2. Mengambil dan mesterilsasikan bintil akar dalam larutan sublimat 0,1% selama 3-4 menit, tergantung ukuran bintilnya. 
3. Mencuci dengan air steril beberapa kali. 
4. Menghancurkan bintil akar dengan batang gelas steril. 
5. Menyiapkan Erlenmeyer 250 ml yang berisi 90 ml air atau larutan fisiologis steril. Memasukkan 10 g bintil akar yang telah dihancurkan ke dalam erlenmeyer secara aseptis. Menggojog hingga kompos tersuspensi.
6. Membuat seri pengenceran sampai 10-3 . 
7. Menyiapkan media YMA dalam petridish, kemudian lakukan inokulasi secara surface plating menggunakan suspense bintil akar pada tiap pengenceran. Inkubasikan pada suhu kamar selama 2x24 jam. 
8. Menyiapkan media agar miring YMA di tabung reaksi. Kemudian lakukan isolasi koloni – koloni bakteri yang dipilih ke dalam agar miring tersebut. Apabila tidak ada koloni yang terpisah secara jelas, ambil dari koloni yang paling memungkinkan, lalu lakukan inokulasi secara goresan pada media YMA pada petridish sehingga diperoleh koloni – koloni yang terpisah secara jelas. Menyimpan pada suhu kamar hingga koloni tumbuh cukup lebat selama 1 minggu. 

2.3.2. Perbanyakan biakan rhizobium dengan sistem bifase 

1. Menuang medium cair dalam medium padat. 
2. Memindahkan biakan dengan ose bakteri dari biakan miring ke erlenmeyer. 
3. Menginkubasikan pada shaker selama 4 -10 hari pada suhu kamar. 

2.3.3. Pembuatan Inokulan Rhizobium 

1. Menentukan jumlah sel bakteri Rhizobium dengan sistem bifase menggunakan Haemacytometer. 
2. Menuang hasil perbanyakan ke dalam pembawa dan bilas dengan air steril sehingga kandungan bakteri per gram 106 - 107.
3. Mengaduk hingga homogen, jika kurang basah dapat ditambah air steril lagi dan masukkan dalam kantong. 
4. Menginkubasikan pada suhu kamar 4 – 10 hari untuk siap digunakan 

2.3.4. Pengujian inokulan

1. Menimbang 10 g pupuk hayati dengan alfoil dan masukkan dalam 90 ml air steril, kemudian gojog hingga homogen. 
2. Membuat pengenceran berturut-turut dari   sampai  
3. Pada setiap seri pengenceran diambil secara aseptik 1 ml dengan pipet steril dan dimasukkan pada permukaan medium YMA dalam petridish. 
4. Meratakan secara aseptik suspensi tersebut dengan menggunakan drigalsky. 
5. Menginkubasikan di tempat gelap pada suhu kamar selama 4–10 hari. 
6. Menghitung jumlah koloni BPN.

III. HASIL PENGAMATAN

Tabel.3.1. Morfologi BPN dari Rhizosfer Pinus

Tabel 3.2. Hasil Isolasi BPN dari Berbagai Sumber Isolat

IV. PEMBAHASAN

     Bakteri penambat nitrogen yang memiliki kemampuan meningkatkan efisiensi penggunaan N-tersedia dalam tanah. Bakteri tersebut menggunakan nitrogen bebas untuk sintesis sel protein dimana protein tersebut akan mengalami proses mineralisasi dalam tanah setelah bakteri mengalami kematian, dengan demikian bakteri berkontribusi terhadap ketersediaan nitrogen untuk tanaman (Danapriatna, 2010). Jumlah koloni pada setiap rhizosfer beranekaragam.

    Ditinjau dari aspek ekologi, bakteri penambat N2 yang mengkolonisasi tanaman gramineae (rumput-rumputan) dapat dikelompokkan menjadi tiga golongan yaitu: (a) bakteri rizosfer penambat N2 (diazotrof) (heterotrofik dan fototrofik); (b) bakteri diazotrof endofitik fakultatif; dan (c) bakteri diazotrof endofitik obligat. Bakteri penambat N2 di daerah perakaran dan bagian dalam jaringan tanaman padi, yaitu Pseudomonas spp., Enterobacteriaceae, Bacillus, Azotobacter, Azospirillum dan Herbaspirillum telah terbukti mampu meningkatkan secara nyata penambatan N2 (James dan Olivares, 2009). Bakteri penambat N2 pada rizosfer tanaman gramineae, seperti Azotobacter paspali dan Beijerinckia spp. termasuk salah satu dari kelompok bakteri aerobik yang mengkolonisasi permukaan akar (Baldani et al., 2009). Azotobacter merupakan bakteri penambat N2 yang mampu menghasilkan substansi zat pemacu tumbuh giberelin, sitokinin, dan asam indol asetat, sehingga pemanfaatannya dapat memacu pertumbuhan akar (Alexander, 2009). Populasi Azotobacter dalam tanah dipengaruhi oleh pemupukan dan jenis tanaman.

     Pengamatan praktikum teknologi pupuk hayati acara I mengenai Bakteri Penambat N2 Rhizobium menggunakan sampel tanah rhizosfer pinus yang diencerkan sampai pada pengenceran ke 10-4 dengan garam fisiologis.  Sampel yang ditanam adalah sampel dengan pengenceran 10-3 dan 10-4. Penanaman dilakukan pada media YMA, dimana media tersebut merupakan media spesifik untuk menumbuhkan bakteri pelarut nitrogen non simbiotik. Hasil identifikasi bakteri yang tumbuh pada pengenceran 10-3 adalah berwarna merah, bentuk bundar, memiliki opacity licin, permukaan timbul dan koloninya berjumlah 21. Pada pengenceran 10-4 didapatkan hasil identifikasi yaitu berwarna merah,  bentuknya bundar, memiliki opacity licin, permukaan yang timbul serta memiliki jumlah koloni 20. 

     Konversi N2 dari udara menjadi amonia dimediasi (dibantu) oleh enzim nitrogenase. Banyaknya N yang dikonversi menjadi amonia sangat tergantung pada kondisi fisik, kimia, dan biologi tanah. Ketersediaan sumber energi (C-organik) di lingkungan rizosfir merupakan faktor utama yang menentukan banyaknya nitrogen yang dihasilkan (Alexander, 1977; Zuberer, 1998). Penambahan sisa-sisa tanaman (biomassa) sebagai sumber C ke dalam tanah memacu perkembangan populasi bakteri penambat N. Ini menjelaskan mengapa jumlah nitrogen yang ditambat oleh bakteri bervariasi di tiap tempat tergantung pada ketersediaan energi dan kemampuan bakteri penambat N2 bersaing dengan mikroba lain yang hidup dan perkembangbiakannya juga bergantung kepada sumber energi yang sama. Mekanisme penambatan nitrogen secara biologis dapat digambarkan melalui persamaan di bawah ini. Dua molekul amonia dihasilkan dari satu molekul gas nitrogen dengan menggunakan 16 molekul ATP dan pasokan elektron dan proton (ion hidrogen).

         N2+ 8 H+ 8 e+ 16 ATP = 2 NH3 + H2+ 16 ADP + 16 Pi                                              (4.1)

Reaksi ini hanya dilakukan oleh bakteri prokariot, menggunakan suatu kompleks enzim nitrogenase. Enzim ini mengandung dua molekul protein yaitu satu molekul protein besi dan satu molekul protein molibdenbesi. Reaksi ini berlangsung ketika molekul N2 terikat pada kompleks enzim nitrogenase. Protein Fe mula-mula direduksi oleh elektron yang diberikan oleh ferredoksin. Kemudian protein Fe reduksi mengikat ATP dan mereduksi protein molibden-besi, yang memberikan elektron kepada N2 sehingga menghasilkan NH=NH. Pada dua daur berikutnya proses ini (masing-masing membutuhkan elektron yang disumbangkan oleh ferredoksin) NH=NH direduksi menjadi H2N-NH2, dan selanjutnya direduksi menjadi NH3. Tergantung pada jenis mikrobanya, ferredoksin reduksi yang memasok elektron untuk proses ini diperoleh melalui fotosintesis, respirasi atau fermentasi.

       Nitrogen bagi tanaman berfungsi sebagai penyusun protoplasma, molekul klorofil, asam nukleat, dan asam amino yang merupakan penyusun protein. Nitrogen memasuki tanah dalam bentuk ammonia dan nitrat (NH3) bersama air hujan, dalam bentuk hasil penambatan N2 oleh mikroba atau dalam bentuk penambahan pupuk sintesis. Kandungan nitrogen tanah yang cukup tinggi lebih banyak disebabkan oleh adanya kemampuan beberapa mikroba untuk memfiksasinya, N organik yang terbentuk kemudian diubah menjadi ammonia melalui proses deaminasi, karena ammonia dapat secara langsung diasimilasikan oleh mikroba atau diubah terlebih dahulu menjadi senyawa nitrat secara nitrifikasi (Nasikah, 2007).

     Biofertilisasi bakteri Rhizobium adalah pemberian bakteri simbiotik Rhizobium penambat nitrogen pada tanaman (Surtiningsih, et al., 2009). Kemampuan bakteri Rhizobium menambat nitrogen telah banyak dilaporkan. Diperkirakan dalam setahun, bakteri ini mampu menambat N udara antara 50 - 600 kg/ha. Angka sebesar itu, jika disetarakan dengan pupuk urea menjadi sekitar 100 – 1300 kg/ha. Pemberian bakteri simbiotik penambat nitrogen diharapkan dapat menambah sumber nitrogen yang murah sehingga membantu mengurangi biaya produksi, mengingat pupuk kimia urea harganya semakin mahal dan penggunaan terus-menerus pupuk kimia tersebut dapat mencemari lingkungan.

     Penggunaan pupuk hayati membawa manfaat yang sangat baik untuk sistem pertanian yang berkelanjutan (sustainable agriculture). Dengan memanfaatkan bakteri penambat N sebagai  agen penyubur (biofertilizer), maka penggunaan dosis pupuk kimia N juga bisa dikurangi. Perkembangan pertanian organik beberapa tahun terakhir ini juga telah menjadikan PNB (Penambatan Nitrogen secara Biologis) sebagai salah satu alternatif untuk diterapkan terutama pada tanaman kacang-kacangan. Pupuk hayati N yang baik dapat diketahui dengan cara melihat informasi pada label kemasan, pupuk yang baik akan mencantumkan tingkat keasaman (pH), kandungan C organik, ijin resmi dari kementerian pertanian, mengandung agensia hayati (mikroorganisme) yang menguntungkan, dan harga jualnya reailistis (tidak terlalu mahal). 

V. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Kesimpulan yang dapat diambil dari acara I mengenai Bakteri Penambat N2 (Rhizobium) adalah :

1. Jumlah koloni pada pengenceran 10-3 yaitu 21 sedangkan pada pengenceran 10-4 yaitu 20
2. Pupuk hayati N yang baik dapat diketahui dengan cara melihat informasi pada label kemasan, pupuk yang baik akan mencantumkan tingkat keasaman (pH), kandungan C organik, ijin resmi dari kementerian pertanian, mengandung agensia hayati (mikroorganisme) yang menguntungkan, dan harga jualnya reailistis (tidak terlalu mahal). 
3. Koloni BPN memiliki warna merah, bentuk bundar, opacity licin, permukaan timbul.

5.2. Saran

      Saran untuk praktikum mengenai Bakteri Penambat N2 (Rhizobium) adalah sebaiknya alat yang digunakan untuk praktikum ditambah sehingga praktikum dapat berjalan lebih cepat dan coass lebih sering dalam memberikan informasi mengenai kejelasan alur praktikum dan jadwal pelaksanaan praktikum sehingga tidak terjadi simpang siur informasi yang tidak jelas.

DAFTAR PUSTAKA

Alexander, M. 2009. Introduction to Soil Mycrobiology. 2nd Ed. John Wiley and Sons. New York. 467 p.

Baldani, et al. 2009.  Recent advances in BNF with non-legume plants. Soil Biol. Biochem. 29(5/6): 911-922.

Danapriatna N. 2010. “Biokimia Penambatan Nitrogen oleh Bakteri Non Simbiotik.”Jurnal Agribisnis dan Pengembangan Wilayah (1) : 1-10. Diakses tanggal 01 Januari 2015.

James, E., and F.L. Olivares. 2009. Infection and colonization of sugarcane and other graminaceous plants by endophytic diazotrophs. Plant Science (17) : 77-119.

Nasikah. 2007. Pengaruh Inokulasi Rhizobium dan Waktu Pemberian Pupuk N (Urea) terhadap Pertumbuhan dan Hasil Kedelai di Lahan Sawah setelah Kedelai (Glycine Max (L) Merril.). Skripsi pada Jurusan Biologi. Fakultas Sains dan Teknologi. Malang : Universitas Islam Negeri Malang.

Surtiningsih, T., Farida, dan T. Nurhariyati. 2009. Biofertilisasi Bakteri Rhizobium pada Tanaman Kedelai (Glycine max(L) Merr.). Berk. Penel. Hayati, 15 : 31–35.